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                      選購HPLC時應考慮的幾個常見問題

                      來源:杭州賽析科技有限公司   時間:-0-0    瀏覽量:118

                      選購HPLC時應考慮的幾個常見問題

                          HPLC系統一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數據記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預柱或保護柱、柱溫控制器等,現代HPLC儀還有微機控制系統,進行自動化儀器控制和數據處理。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。

                          最早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長的檢測器、繪圖儀,繪出的峰是通過手工測量計算峰面積。后來的高壓泵精度很高并可編程進行梯度洗脫,柱填料從單一品種發展至幾百種類型,檢測器從單波長至可變波長檢測器、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測器、可確證物質結構的質譜檢測器。數據處理不再用繪圖儀,逐漸取而代之的是最簡單的積分儀、計算機、工作站及網絡處理系統。

                          目前常見的HPLC儀生產廠家國外有Waters公司、Agilent公司(原HP公司)、島津公司等,國內有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。

                      一、輸液泵

                          輸液泵是HPLC系統中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個系統的質量和分析結果的可靠性。輸液泵應具備如下性能:①流量穩定,其RSD應<0.5%,這對定性定量的準確性至關重要;②流量范圍寬,分析型應在0.1~10 ml/min范圍內連續可調,制備型應能達到100 ml/min;③輸出壓力高,一般應能達到150~300 kg/cm2;④液缸容積??;⑤密封性能好,耐腐蝕。

                          泵的種類很多,按輸液性質可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結構又可分為螺旋注射泵、柱塞往復泵和隔膜往復泵。恒壓泵受柱阻影響,流量不穩定;螺旋泵缸體太大,這兩種泵已被淘汰。目前應用最多的是柱塞往復泵。柱塞往復泵的液缸容積小,可至0.1ml,因此易于清洗和更換流動相,特別適合于再循環和梯度洗脫;改變電機轉速能方便地調節流量,流量不受柱阻影響;泵壓可達400kg/cm2。其主要缺點是輸出的脈沖性較大,現多采用雙泵系統來克服。雙泵按連接方式可分為并聯式和串聯式,一般說來并聯泵的流量重現性較好(RSD為0.1%左右,串聯泵為0.2~0.3%),但出故障的機會較多(因多一單向閥),價格也較貴。

                      二、進樣器

                          早期使用隔膜和停流進樣器,裝在色譜柱入口處?,F在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求:密封性好,死體積小,重復性好,保證中心進樣,進樣時對色譜系統的壓力、流量影響小。HPLC進樣方式可分為:隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。

                      1.隔膜進樣。用微量注射器將樣品注入專門設計的與色譜柱相連的進樣頭內,可把樣品直接送到柱頭填充床的中心,死體積幾乎等于零,可以獲得最佳的柱效,且價格便宜,操作方便。但不能在高壓下使用(如10MPa以上);此外隔膜容易吸附樣品產生記憶效應,使進樣重復性只能達到1~2%;加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到,常規分析使用受到限制。

                      2.停流進樣??杀苊庠诟邏合逻M樣。但在HPLC中由于隔膜的污染,停泵或重新啟動時往往會出現“鬼峰”;另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中,效果較好。

                      3.閥進樣。一般HPLC分析常用六通進樣閥(以美國Rheodyne公司的7725和7725i型最常見),其關鍵部件由圓形密封墊(轉子)和固定底座(定子)組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在,柱效率低于隔膜進樣(約下降5~10%左右),但耐高壓(35~40MPa),進樣量準確,重復性好(0.5%),操作方便。

                      4.自動進樣。用于大量樣品的常規分析。

                      三、色譜柱

                      色譜是一種分離分析手段,分離是核心,因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好,分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球(包括離子交換樹脂)、多孔碳等,其粒度一般為3,5,7,10μm等,柱效理論值可達5~16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數的柱效;對于同系物分析,只要500即可;對于較難分離物質對則可采用高達2萬的柱子,因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復雜混合物分析的需要。

                      柱效受柱內外因素影響,為使色譜柱達到最佳效率,除柱外死體積要小外,還要有合理的柱結構(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術。即使最好的裝填技術,在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的,靠近管壁的部位比較疏松,易產生溝流,流速較快,影響沖洗劑的流形,使譜帶加寬,這就是管壁效應。這種管壁區大約是從管壁向內算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統中,柱外效應對柱效的影響遠遠大于管壁效應。

                      1.柱的構造

                          色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環)、篩板(濾片)、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成,壓力不高于70 kg/cm2
                      時,也可采用厚壁玻璃或石英管,管內壁要求有很高的光潔度。為提高柱效,減小管壁效應,不銹鋼柱內壁多經過拋光。也有人在不銹鋼柱內壁涂敷氟塑料以提高內壁的光潔度,其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的,用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板,是燒結不銹鋼或鈦合金,孔徑0.2~20μm(5~10μm),取決于填料粒度,目的是防止填料漏出。

                      色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類,尺寸規格也不同:①常規分析柱(常量柱),內徑2~5mm(常用4.6mm,國內有4mm和5mm),柱長10~30cm;②窄徑柱(narrow
                      bore,又稱細管徑柱、半微柱semi-microcolumn),內徑1~2mm,柱長10~20cm;③毛細管柱(又稱微柱microcolumn),內徑0.2~0.5mm;④半制備柱,內徑>5mm;⑤實驗室制備柱,內徑20~40mm,柱長10~30cm;⑥生產制備柱內徑可達幾十厘米。柱內徑一般是根據柱長、填料粒徑和折合流速來確定,目的是為了避免管壁效應。

                      2.柱的發展方向

                          因強調分析速度而發展出短柱,柱長3~10cm,填料粒徑2~3μm。為提高分析靈敏度,與質譜(MS)聯接,而發展出窄徑柱、毛細管柱和內徑小于0.2mm的微徑柱(microbore)。細管徑柱的優點是:①節省流動相;②靈敏度增加;③樣品量少;④能使用長柱達到高分離度;⑤容易控制柱溫;⑥易于實現LC-MS聯用。

                      但由于柱體積越來越小,柱外效應的影響就更加顯著,需要更小池體積的檢測器(甚至采用柱上檢測),更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設備應具備如下性能:輸液泵能精密輸出1~100μl/min的低流量,進樣閥能準確、重復地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小,要求高靈敏度的檢測器,電化學檢測器和質譜儀在這方面具有突出優點。

                      3.柱的填充和性能評價

                          色譜柱的性能除了與固定相性能有關外,還與填充技術有關。在正常條件下,填料粒度>20μm時,干法填充制備柱較為合適;顆粒<20μm時,濕法填充較為理想。填充方法一般有4種:①高壓勻漿法,多用于分析柱和小規模制備柱的填充;②徑向加壓法,Waters專利;③軸向加壓法,主要用于裝填大直徑柱;④干法。柱填充的技術性很強,大多數實驗室使用已填充好的商品柱。

                      必須指出,高效液相色譜柱的獲得,裝填技術是重要環節,但根本問題還在于填料本身性能的優劣,以及配套的色譜儀系統的的結構是否合理。

                          無論是自己裝填的還是購買的色譜柱,使用前都要對其性能進行考察,使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下(樣品、流動相、流速、溫度)下的柱壓、理論塔板高度和塔板數、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復性,或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復性在±5%或±10%以內。進行柱效比較時,還要注意柱外效應是否有變化。一份合格的色譜柱評價報告應給出柱的基本參數,如柱長、內徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。

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